アポトーシス

DNA断片化

蛍光顕微鏡法あるいはフローサイトメトリーによって細胞群内のアポトーシス細胞を識別するために、DNAの凝集と損傷を検出する方法が一般的に使用されています。Invitrogenは、TUNELアッセイ^1,2に適合性を示す幾つかのDNA染色剤とDNA laddering^3,4検出用に幾つかのDNA染色剤を提供しています。

DNA断片化検出プローブ

製品	注釈
APO-BrdU TUNELアッセイキット	キットにはターミナルトランスフェラーゼ、Alexa Fluor 488色素標識anti-BrdU抗体と陽性および陰性対照細胞が含まれている。 全てのTUNELアッセイ試薬がひとつのキットに入っている。
ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP	BODIPY FLによるDNA鎖切断を直接標識するのに有用。 Anti-BrdU抗体は必要なく、ターミナルトランスフェラーゼのみご用意いただく必要がある。
ChromaTide Texas Red-12-dUTP	Texas RedによるDNA鎖切断を直接標識するのに有用である。 Anti-BrdU抗体は必要なく、ターミナルトランスフェラーゼのみご用意いただく必要がある。
BrdUTP	TUNELアッセイのひとつの成分 ターミナルトランスフェラーゼとanti-BrdU抗体をご用意いただく必要がある。
Anti-BrdU抗体コンジュゲート	マウスモノクローナル抗体、PRB-1(IgG1サブクラス)はBrdU標識切断を検出するのに有用。 未標識、ビオチン化標識あるいは6種類のAlexa Fluor色素で標識したものを使用することができる。
SYBRGreen I色素	感受性の高い核酸染色剤であり、dsDNAに結合すると明るい蛍光を発する。 大量のDNA中のladderingを検出したり、コメットアッセイを使用してひとつの細胞中のアポトーシスDNA断片化を検出するのに有用。

TUNELアッセイ

アポトーシスの間に生じるDNA断片は、TUNELアッセイで識別されます。これは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を使用して、断片化したDNA末端にBrdUTPを付加します。その後、BrdUはanti-BrdU抗体で検出されます。当社のAPO-BrdU TUNELアッセイキットをお選びください。BrdUを取り込むために、このキットには緩衝液と試薬の他にAlexa Fluor488標識anti-BrdU抗体と、陽性コントロールおよび陰性コントロールとして使用される固定細胞試料が含まれています。Alexa Fluor色素についてはレファレンスDをご覧ください。

直接、DNA断片を標識するために、当社はChromaTide BODIPY FL-14-dUTPとChromaTide Texas Red-12-dUTPを提供しています5。これら蛍光を発するdUTP類似化合物を、標準ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応を行うDNA断片に加えます。BrdUを取り込み、その後識別するために、当社では用途に合わせてBrdUTPと蛍光色範囲のanti-BrdUマウスIgG₁モノクローナル抗体のコンジュゲートも提供しています。この抗体は、他の検出方法が優先されると思われる用途に対して、蛍光標識することなく利用することができます。

カンプトテシンで処理したHL-60細胞。アポトーシスを起こしているDNA鎖は、ChromaTide BODIPY FL-14-dUTPヌクレオチドを用いるTUNELアッセイによって検出した。画像は、Zbigniew Darzynkiewicz氏(Cancer Research Institute, New York Medical College)からの提供。

カンプトテシンで処理し、APO-BrdU TUNELアッセイキットで染色したヒトリンパ腫細胞。アポトーシス細胞=緑色(TUNEL)、死細胞=赤(プロピジウムアイオダイド)。

抗 BrdUマウスモノクローナル抗体、PRB-1(IgG₁サブクラス)の標識

色素	Ex/Em*	Cat.No.
*：最大励起波長(Ex)および最大蛍光波長(Em)、 NA＝なし
Unconjugated	NA	A21300
Alexa Fluor 488	495/519	A21303
Alexa Fluor 546	556/573	A21308
Alexa Fluor 594	590/617	A21304
Alexa Fluor 647	650/665	A21305
Biotin	NA	A21301MP

DNA断片化をin vitroにて検出するSYBR Green I 核酸染色剤

SYBR Green I 核酸染色剤は、例外的に感受性の高い核酸ゲル染色剤であり、dsDNAに結合し、ゲル中のバックグラウンドが低い時には、明るい蛍光を発します。そのため、in vitroでの核酸染色に適しています。DNAを大量に調製したときのladderingの有無を明らかにしたり、コメットアッセイを用いてひとつの細胞でアポトーシスを起こしているDNA断片を検出するには^6,7、SYBR Green I 色素は理想的な試薬です。その他の核酸染色色素については、「オルガネラと細胞骨格」の章の「固定細胞の核酸染色」の節と「生細胞の核酸染色」の節を参照ください。

SYBR Green I 核酸ゲル染色剤を用いたコメットアッセイでは、DNAの酸化的損傷に関連するDNA断片が認められる。

SYBR Green I 核酸ゲル染色剤で染色したカンプトテシン処理HL-60細胞由来DNA抽出物。アポトーシスを起こしている細胞に特徴的な200〜5000 bpのDNA断片が認められる。細胞は、Zbigniew Darzynkiewicz氏(Cancer Research Institute, New York Medical College)から譲り受けた。

参考文献:

1. J Cell Biol 119, 493 (1992); 2. Cytometry 20, 245 (1995); 3. Biotechniques 15, 1032 (1993); 4. Nucleic Acids Res 21, 4206 (1993); 5. Exp Cell Res 222, 28 (1996); 6. Mutat Res 478, 89 (2001); 7. Methods Mol Biol 100, 301 (1998).

製品：

Cat.No.	製品名	サイズ
A21300	anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1 (anti-BrdU)	350 μL
A21301MP	anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, biotin-XX conjugate (anti-BrdU, biotin conjugate)	350 μL
A21303	anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor 488 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor 488 conjugate)	350 μL
A21304	anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor 594 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor 594 conjugate)	350 μL
A21305	anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor 647 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor 647 conjugate)	350 μL
A21308	anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor 546 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor 546 conjugate)	350 μL
A23210	APO-BrdU TUNEL Assay Kit *with Alexa Fluor 488 anti-BrdU* *60 assays*	1 kit
B21550	5-bromo-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate (BrdUTP) *10 mM in TE buffer*	25 μL
C7614	ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP *1 mM in TE buffer*	25 μL
C7631	ChromaTide Texas Red-12-dUTP *1 mM in TE buffer*	25 μL
S7563	SYBR Green I nucleic acid gel stain *10,000X concentrate in DMSO*	500 μL
S7567	SYBR Green I nucleic acid gel stain *10,000X concentrate in DMSO*	1 mL
S7585	SYBR Green I nucleic acid gel stain *10,000X concentrate in DMSO* *special packaging*	20 x 50 μL