アポトーシス

細胞内ホメオスタシス（イオンインジケーター）

細胞内環境の変化がアポトーシスプロセスで重要な影響因子になります。当社の色素は、細胞内の微妙なpH変化をモニターし、細胞内のCa²⁺とZn²⁺の濃度変化を測定する理想的な色素です。

細胞内ホメオスタシス変化検出プローブ

製品	検出	備考
BCECF	細胞内pH	緑色色素 レシオメトリック(比率測定); 450 nmと500 nmで励起し、535 nmの蛍光を読み取る。
カルボキシ SNARF-1	細胞内pH	赤色色素 レシオメトリック(比率測定); 488 nmで励起し、580 nmと640 nmの蛍光を読み取る。
Fluo-4 Fluo-4NW	細胞内[Ca2+]	488 nm励起による蛍光がFluo-3の約2倍 緑色色素 励起は可視光 Ca2+に結合すると蛍光増感 Fluo4-NWは消失色素不要で信頼性がより高い製品
Fura-2	細胞内[Ca2+]	緑色色素 励起はUV光 レシオメトリック(比率測定); 340/380 nmの励起比、510 nmの蛍光を読み取る。
RhodZin-3	ミトコンドリア [Zn2+]	赤色色素 Kd〜65 nm Ca2+非感受性

アセトキシメチル(AM)と酢酸エステル

蛍光インジケーターとキレーターのアセトキシメチル(AM)と酢酸エステルは、生細胞の試験に最も有用な化合物群のひとつです。AMエステル基でカルボン酸を修飾すると、細胞膜を透過することができる非荷電分子が生じます。細胞内に入ると、この脂質親和性保護基は非特異的エステラーゼによって切断され、もとのエステル化合物よりもはるかに細胞から漏出しにくい荷電形が生じます。

細胞内pH

pH感受性色素であるBCECF AMとカルボキシSNARF-1 AM酢酸エステルはアポトーシスに酸性化がどのような役割を果たしているのかを研究する有用なツールです¹。どちらも蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光分光法に対応します。BCECF AMとカルボキシSNARF-1 AMは生細胞では膜透過性を示しますが、固定後、これらの色素は保持されません。BCECF AMとカルボキシSNARF-1 AMは凍結乾燥品としてご利用いただけます。SNARF-1 AMはDMSO溶液としてもご利用いただけます。

BCECFのアセトキシメチル(AM)エステルは膜透過性で、pH7.8では4〜5個の負電荷を有しており、そのおかげで浮遊細胞へ非侵襲的に導入され、色素が十分に保持されます。正常範囲の細胞質pH(6〜8)ではBCECF AMのpKaは7.0です。BCECF AMはpH依存性蛍光励起プロファイルを有しているため、レシオメトリック測定(比率測定)が可能です。この色素の塩基性時のフォームの最大吸収波長は、488 nmのアルゴンイオンレーザー線に非常に近い値です。

カルボキシSNARF-1 AMの室温でのpKaは〜7.5なので、pH7〜pH8のpH変化を測定するのに有用です。蛍光スペクトルは、黄橙色(酸性条件)から暗赤色(塩基性条件)へとpH依存的にシフトします。この色素は、アルゴンイオンレーザーの488 nm線と514 nm線の両方によって効果的に励起されます。励起は通常ひとつの波長(488 nmと530 nmの間)で生じますので、580 nmと640 nmの両方で蛍光をモニターします。両方の蛍光波長における蛍光強度の比を利用して、より正確にpHを測定することができます。

細胞内マーカー色素のローディングと保持の特性。ヒトリンパ系細胞(GePa)に以下の細胞透過性アセトキシメチルエステル(AM)またはフルオレセインの酢酸エステル誘導体をロードした。すなわち、1)カルセインAM、2)BCECF AM、3)フルオレセイン・ジアセテート(FDA)、4)カルボキシフルオレセイン・ジアセテート(CFDA)、5)CellTracker Green CMFDA(5-クロロメチルフルオレセイン・ジアセテート)である。細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析し、細胞当たりの平均蛍光を測定した。その後、保持された細胞試料を再インキュベートし、再分析した。細胞当たりの平均蛍光強度の低下は、2回目のインキュベーション期間中に細胞からどのくらい色素が漏出したかを示す。

デュアル・エミッション・pHインジケーターであるindo-1 AMと、デュアル・エミッションCa²⁺インジケーターであるカルボキシSNARF-1-AM酢酸エステルで標識したラット下垂体中葉のメラノトロープ。indo-1由来の405 nmと475 nmでの蛍光を擬似着色して示した(左図)。またカルボキシSNARF-1由来の575 nmと640 nmの蛍光も擬似着色して示した(右図)。画像はStephen J. Morris氏(University of Missouri-Kansas City)とDiane M. Beatty(Invitrogen)からの提供。

A)488 nm、B)514 nm、C)534 nmで励起したカルボキシSNARF-1のpH依存性蛍光スペクトル

BCECFのpH依存性スペクトル:A)吸収スペクトル、B)蛍光スペクトル、C)励起スペクトル。BCECFの439 nmの等吸収点を示すことができるように左側に蛍光励起スペクトルを拡大した。

細胞内Ca²⁺

細胞内Ca²⁺濃度の変化はアポトーシスを誘発することが知られています²。本節で説明するCa²⁺反応性色素のアセトキシメチルエステルは細胞透過性であるため、生細胞を染色するのに有用です。これはCa²⁺と結合すると、蛍光強度が大幅に増大し、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光分光法に使用されています^3〜7。固定後はfluo-4色素とfura-2色素は保持されません。

Fluo-4 AMは488 nm単一波長光源用(レシオメトリック測定用の2波長励起が不要)の蛍光色素であり、アルゴンレーザーで効果的に励起されます。これはCa²⁺と結合すると、少なくとも100倍、蛍光増感が認められます⁸。広く使用されているfluo-3に対し、488 nm励起による蛍光強度が約2倍になります。従って、細胞にローディングする色素が少なくて済み、インキュベーション時間が短くて済みます。fluo-3のふたつの塩素置換基をフッ素に置き換えたこと以外は、fluo-4の分子構造はfluo-3と同じで、特性は非常に類似しているので、プロトコールを変える必要はありません。データ例は、http://www.invitrogen.jp/products/pdf/2004-36-CB.pdf をご覧ください。fluo-4 AM色素は、凍結乾燥品、高純度FluoroPure凍結乾燥品、DMSO溶液として提供されています。

Fluo-4 NW（No Wash）は消失色素が不要なので、消失色素によりおこる恐れのある非特異的な相互作用を取り除くことにより、生物学的な状況での細胞シグナルの測定ができます。洗浄ステップが不要なので、洗浄ステップに伴う不確実性が減りZ'ファクター（アッセイごとの信頼性）がより高くなります。またハイスループットモードでの接着性細胞でも非接着性細胞でも強力にスクリーニングできます。さらにGeneBLAzerテクノロジーと組み合わせれば、より細かな解析ができ、ヒットしたデータの確認ができます。

Fura-2 AMはUV光励起可能なCa²⁺インジケーターであり、顕微鏡によるCa²⁺のレシオメトリック測定(比率測定)には第一選択色素です。fura-2 AMの測定には340/380 nmの励起比が通常使用されています。〜510 nmの蛍光をモニターすると、Ca²⁺依存性吸収シフトを見ることができます。Fura-2 AMは凍結乾燥品、高純度FluoroPure凍結乾燥品、DMSO溶液として提供されています。

Gタンパク質結合受容体活性化のためのハイスループットCa²⁺インフラックスアッセイ。オルファニンFQ受容体とGa_qi3キメラGタンパク質にコトランスフェクションしたCHO(DHFR-)細胞に4 µM fluo-3 AMまたはfluo-4 AMをロードした。Ca²⁺依存性蛍光は488 nm励起を用いて生成させた。Ca²⁺過電流は、25 nMオルファニンFQ(ノシセプチン)を添加することによって開始した。各トレースは5回記録した過渡電流の平均値である。データは、Sven Merten氏、Hans-Peter Nothacker氏およびOlivier Civelli氏(University of California, Irvine)からの提供。

マウス胎児小脳のプルキンエニューロンの遊離Ca²⁺濃度の偽着色画像。ニューロンにfura-2の五カリウム塩をロードし、次に、細胞外Ca²⁺が存在しない状態でtrans-ACPDを投与した。この合成画像は、340 nmと380 nmそれぞれで励起して得られた画像の比を表す。画像は、D. J. Linden氏(Johns Hopkins University)とM. Smeyne氏およびJ. A. Connor氏(Roche Institute of Molecular Biology)からの提供。

ラット心室心筋細胞における自発的Ca²⁺スパークの急速共焦点記録。単離された心筋細胞にfluo-4 AMをロードした。パネルAはそれぞれの細胞の輪郭と、パネルBに示した動的トレースが得られた4箇所の位置の平均を示す。パネルCはパネルAの黒色領域周辺で撮影した一連の共焦点画像を示す。これは、個々のCa²⁺スパークの空間時間的な特性を示す。画像は、Peter Lipp氏(The Babraham Institute, Cambridge, UK)より提供を受け、Biomedical Products 9、52 (2001)の許可を受けて再現したものである。

0〜39.8 µMの遊離Ca²⁺を含む溶液におけるfura-2蛍光励起スペクトル

細胞内Zn²⁺

Invitrogenは、生細胞用の新しい蛍光Zn²⁺インジケーターであるRhodZin-3 AMを販売しています9。RhodZin-3 AMはZn²⁺に対してはナノモルの親和性を示しますが、生理学的濃度のCa²⁺には感受性を示しません。RhodZin-3 AMはミトコンドリアに局在しており、ミトコンドリア内の遊離Zn²⁺と結合すると、pHに依存して蛍光が大幅に増加します。ミトコンドリアのZn²⁺を検出することは重要なことです。プログラムされた細胞死の初期段階での独特な特徴は、活性を有するミトコンドリアの破壊です10?12。RhodZin-3 AMは凍結乾燥品として提供されています。ミトコンドリアに限らない細胞内のZn²⁺インジケーターとしてはFluo Zin-3が優れています。

上記のほかイオンインジケーターとして、fluo-3, coelenterazine(セレンテラジン), Calcium Green, Indo-1, Fura Red, Oregon Green 488 BAPTA-1などのCaインジケーター、Mag-Fura-2などのMgインジケーター、CoroNa Green, Sodium GreenのようなNaインジケーター、SBFI, PBFIのようなKインジケーター、MQAE, MEQのようなClインジケーター、nigericin, SNARF-4F 5-(and-6)などのpHインジケーターも扱っています。

ミトコンドリアの遊離亜鉛を検出するRhodZin-3 AMで染色し、次に、ミトコンドリア特異的染色剤であるMitoTracker Green FMで染色した、ウシ肺動脈上皮生細胞。黄橙色蛍光領域ではこれら色素が同じところに局在しているのが示される。

参考文献:

1. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 654 (1996); 2. J Physiol 527 Pt 1, 71 (2000); 3. Methods Cell Biol 40, 155 (1994); 4. Methods Cell Biol 56, 237 (1998); 5. New Phytol 153, 527 (2002); 6. Physiol Rev 79, 1089 (1999); 7. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, 2nd Ed., Mason WT, Ed., pp. 40?50 (1999); 8. Biophys J 65, 865 (1993); 9. Cell Calcium 34, 281 (2003); 10. Science 292, 624 (2001); 11. Science 289, 1150 (2000); 12. Trends Cell Biol 10, 369 (2000).

製品：

Cat.No.	製品名	サイズ	関連イオン
B1150	2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF, AM)	1 mg	pH
B1170	2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF, AM) *special packaging*	20 x 50 µg	pH
B3051	2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF, AM) *1 mg/mL solution in dry DMSO*	1 mL	pH
B6790	BTC, tetrapotassium salt *cell impermeant*	1 mg	Ca
B6810	bis-fura-2, hexapotassium salt *cell impermeant*	1 mg	Ca
C1270	5-(and-6)-carboxy SNARFR-1	1 mg	pH
C1271	5-(and-6)-carboxy SNARFR-1, acetoxymethyl ester, acetate	1 mg	pH
C1272	5-(and-6)-carboxy SNARFR-1, acetoxymethyl ester, acetate *special packaging*	20 x 50 µg	pH
C14260	coelenterazine cp	250 µg	Ca
C24430	CoroNa Red chloride	1 mg	Na
C2944	coelenterazine	250µg	Ca
C3009	Calcium Calibration Buffer Kit #2 *zero to 10 mM CaEGTA (11 x 10 mL)	1 kit	Ca
C3012	Calcium Green-1, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
C3015	Calcium Orange, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
C36676	CoroNa Green, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	Na
C3713	Calcium Green-1 dextran, potassium salt, 10,000 MW, anionic	5 mg	Ca
C3730	Calcium Green-2, octapotassium salt *cell impermeant*	500 µg	Ca
C3732	Calcium Green-2, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
C3737	Calcium Green-5N, hexapotassium salt *cell impermeant*	500 µg	Ca
C6765	Calcium Green-1 dextran, potassium salt, 3000 MW, anionic	5 mg	Ca
C6780	coelenterazine h	250 µg	Ca
C6826	5-(and-6)-chloromethyl SNARFR-1, acetate *mixed isomers* *special packaging*	20 x 50 µg	pH
E3101	N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide (MQAE)	100 mg	Cl
F1200	fura-2, pentapotassium salt *cell impermeant*	1 mg	Ca
F1201	fura-2, AM *cell permeant*	1 mg	Ca
F1221	fura-2, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	Ca
F1225	fura-2, AM *1 mM solution in dry DMSO* *cell permeant*	1 mL	Ca
F1241	fluo-3, AM *cell permeant*	1 mg	Ca
F1242	fluo-3, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	Ca
F14185	fura-2, AM *FluoroPure grade* *special packaging*	20 x 50 µg	Ca
F14200	fluo-4, pentapotassium salt *cell impermeant*	500 µg	Ca
F14201	fluo-4, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
F14202	fluo-4, AM *packaged for high-throughput screening*	5 x 1 mg	Ca
F14204	fluo-5N, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
F14217	fluo-4, AM *1 mM solution in DMSO* *cell permeant*	500 µL	Ca
F14218	fluo-3, AM *1 mM solution in DMSO* *cell permeant*	1 mL	Ca
F23915	fluo-3, AM *FluoroPure grade* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
F23917	fluo-4, AM *FluoroPure grade* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
F24195	FluoZin-3, AM *cell permeant*	1 x 100 µg	Zn
F3020	Fura Red, AM *cell permeant*	500 µg	Ca
F3021	Fura Red, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
F3029	fura dextran, potassium salt, 10,000 MW, anionic	5 mg	Ca
F36205	Fluo-4 NW Calcium Assay Kit (high thgoughput)	100 plates	Ca
F36206	Fluo-4 NW Calcium Assay Kit (starter pack with buffer)	10 plates	Ca
F3715	fluo-3, pentapotassium salt *cell impermeant*	1 mg	Ca
F6774	Fura-2 Calcium Imaging Calibration Kit *zero to 10 mM CaEGTA, 50 µM fura-2 (11 x 1 mL)*	1 kit	Ca
I1202	indo-1, pentapotassium salt *cell impermeant*	1 mg	Ca
I1223	indo-1, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	Ca
I1226	indo-1, AM *1 mM solution in dry DMSO* *cell permeant*	1 mL	Ca
I24221	(S)-1-p-isothiocyanatobenzyldiethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA isothiocyanate)	1 mg	Ca
M1290	mag-fura-2, tetrapotassium salt ＊cell impermeant*	1 mg	Mg
M1291	mag-fura-2, AM *cell permeant*	1 mg	Mg
M1292	mag-fura-2, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	Mg
M6886	6-methoxy-N-ethylquinolinium iodide (MEQ)	100 mg	Cl
N1495	nigericin, free acid	10 mg	pH
O23990	Oregon GreenR 488 BAPTA-6F, hexapotassium salt *cell impermeant*	500 µg	Ca
O6798	Oregon GreenR 488 BAPTA-1 dextran, potassium salt, 10,000 MW, anionic	5 mg	Ca
O6806	Oregon GreenR 488 BAPTA-1, hexapotassium salt *cell impermeant*	500 µg	Ca
O6807	Oregon GreenR 488 BAPTA-1, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Ca
P1265MP	PBFI, tetraammonium salt *cell impermeant*	1 mg	K
P1267MP	PBFI, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	K
R1244	rhod-2, AM *cell permeant*	1 mg	Ca
R36351	RhodZin-3, AM *cell permeant* *special packaging*	10 x 50 µg	Zn
S1263	SBFI, AM *cell permeant*	1 mg	K
S1264	SBFI, AM *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	K
S23921	SNARFR-4F 5-(and-6)-carboxylic acid, acetoxymethyl ester, acetate *special packaging*	20 x 50 µg	pH
S6900	Sodium Green, tetra(tetramethylammonium) salt *cell impermeant*”	1 mg	Na
S6901	Sodium Green tetraacetate *cell permeant* *special packaging*	20 x 50 µg	Na