細胞増殖および生存率用ツール
細胞増殖
細胞数をカウントし、細胞増殖を定量する試薬は、研究用および診断用のツールとして使用できます。現在、細胞分裂中の細胞に特異的に取り込むことができ、直接、単一細胞ベースで検出することのできる蛍光試薬はありません。従って、ほとんどの細胞増殖アッセイでは、3H-チミジンか5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)のどちらかを増殖中の細胞に取り込むか、ATP産生のような代謝活性によるか、溶解した細胞の総核酸あるいはタンパク質含有量を測定することによって細胞数を推定しています1,2。Invitrogenは、このような一般的なアッセイに基づいて細胞増殖を研究するためのキットと試薬の数種類を開発しました。
インビトロジェンの細胞増殖アッセイと試薬
| 製品 |
アッセイ/標識されるもの |
備考 |
| CyQUANT細胞増殖アッセイキット |
細胞中の核酸の量 |
- 核酸含有量は細胞数の妥当なインジケーターである。
- 核酸に基づくアッセイは、細胞代謝の変化には無関係である。
- キットは、核酸と結合すると蛍光増感するCyQUANT GR色素をベースにしている。
|
| BrdU取り込みを検出するキットと試薬 |
DNA合成 |
- ABSOLUTE-S SBIP細胞増殖キットは、追加の細胞染色を可能にする方法を用いてBrdUの取り込みを識別する。
- Invitrogenでは、抗BrdU抗体の蛍光標識やビオチン化コンジュゲートとdUTPの蛍光コンジュゲートも提供している。
|
| リジン反応性
CFDA SE (CFSE)色素 |
細胞内および細胞表面タンパク質 |
- 細胞タンパク質のリジン側鎖と反応する。
- 細胞が分裂する時、娘細胞に標識が等しく分配される。
- 細胞の連続する世代を追跡するのに有用である。
|
| 脂質親和性カルボシアニン色素 |
原形質膜 |
- 原形質膜内に挿入すると、外側に拡散して、細胞全体を染色する。
- 細胞分裂時に、娘細胞に標識が等しく分配される。
- 次世代の細胞を追跡するのに有用である。
|
細胞のDNA定量
細胞のDNAとRNAのレベルは厳密に調節されているので、細胞の核酸量は妥当な細胞数インジケーターになります3。個々の細胞のDNAとRNAのレベルは時間が経過するにつれて有意に変動しますが、所定の細胞群における核酸の全体量は、細胞が非同期である限りは、変化しません。さらに、核酸結合に基づくアッセイは、一般的に細胞代謝の変化とは無関係です。従って、核酸量の変化は、細胞の増殖に影響を与える細胞毒性事象あるいは病的異常ばかりでなく、全体的な細胞増殖の高感度インジケーターとして使用することができます。
CyQUANT細胞増殖アッセイキットでは、簡便で迅速かつ高感度な方法で、培養物中の細胞密度を測定することができます4。このアッセイは、200 μL容量では50以下の細胞から少なくとも50,000細胞まで直線性を示すので、マイクロプレートで簡便に行うことができます。色素濃度を上げると、直線範囲は250,000細胞まで拡大することができます。このアッセイは細胞代謝活性に依存していないので、アッセイ前に細胞を凍結することができます。また、様々な時点で得られたデータを直接比較することができます。このキットは、当社が特許を有する色素CyQUANT GRをベースにしています。細胞の核酸と結合すると蛍光が増し、他の細胞成分からの干渉はおこりません(最大励起/蛍光?480/520 nm)。このキットには、アッセイ容量200 μLで1,000アッセイを行うのに十分な試薬が含まれています。CyQUANT細胞溶解緩衝液も単品試薬としてご購入いただけます。
CyQUANT細胞増殖アッセイキットでは、簡便で迅速かつ高感度な方法で、培養物中の細胞密度を測定することができます4。このアッセイは、200 μL容量では50以下の細胞から少なくとも50,000細胞まで直線性を示すので、マイクロプレートで簡便に行うことができます。色素濃度を上げると、直線範囲は250,000細胞まで拡大することができます。このアッセイは細胞代謝活性に依存していないので、アッセイ前に細胞を凍結することができます。また、様々な時点で得られたデータを直接比較することができます。このキットは、当社が特許を有する色素CyQUANT GRをベースにしています。細胞の核酸と結合すると蛍光が増し、他の細胞成分からの干渉はおこりません(最大励起/蛍光?480/520 nm)。このキットには、アッセイ容量200 μLで1,000アッセイを行うのに十分な試薬が含まれています。CyQUANT細胞溶解緩衝液も単品試薬としてご購入いただけます。
またCyQUANT NF試薬（細胞透過性DNA結合色素）と原形質膜透過性試薬とを組み合わせることにより、凍結融解による細胞リシスを置換した、CyQUANT NF Assay Kitもご用意しています。
従来のCyQUANTアッセイ
CyQUANT NFアッセイ
ATP測定法に比べたCyQUANTキットの利点
| 増殖アッセイ |
備考 |
| CyQUANT細胞増殖アッセイキット |
- アッセイの前に細胞試料を凍結することができる。
- 薬剤処理後に有意な変化を示さない細胞の核酸レベルに基づくアッセイである。
- アッセイの結果は標準的な蛍光マイクロプレートリーダーを用いて読み取ることができる。
- アッセイ試薬混合後、2〜30分までの範囲ではいつでも蛍光シグナルを読み取ることができる。
|
| ATP検出キット |
- ATPは長期間の保存には耐えられない。即座にアッセイを行わなければならない。
- 薬剤処理後のATPの増加あるいは減少は、必ずしも細胞数に関連していない。
- 化学発光シグナルを正確に検出するためには特別な注入システムが必要である。
- アッセイ試薬混合後、10分以内にシグナルを読み取らなければならない。
|
CyQuant® シリーズの比較
| |
CyQuant® |
CyQuant® NF |
CyQuant® Direct |
線形性
（細胞数） |
50 - 50,000(最も高感度) * |
100 - 20,000 |
50以下 - 20,000 |
| アッセイの長さ |
最低3時間 |
1時間 |
1時間 |
最適アッセイ
デザイン |
複数の日に及ぶ実験
またはエンドポイント実験 |
リアルタイムデータ解析 |
リアルタイムデータ解析 |
| 凍結ステップ |
必要 |
不要 |
不要 |
| サンプル容量 |
200µl |
100µl |
100µl(96-well plate)
25µl(384-well plate)
5µl(1586-well plate) |
励起/蛍光の
最大波長 |
480/520 nm |
497/520 nm |
508/527 nm |
バリデート
された細胞株 |
Mouse fibroblasts(NIH3T3,CREBAG 2 cells),normal human umbilical endothelial cells(HUVEC),canine kidney cells(MDCK),chinook samon embryo cells(RBL,rat glioma cells(C6) and mouse myeloma cells |
HEK 293,HeLa,HepG2,3T3 and CHO cells |
接着細胞 : CHO-K1,Hep-G2,U87,MDA-MB-231,SNU-1,PC-3,human primary aortic smooth muscle cells(HASMC),human primary pulmonary arterial smooth muscle cells(HPASMC),human kerationocytes,and HUVEC
浮遊細胞 : Jurkat |
*細胞凍結により核酸が放出・分散しているため
DNA合成
新たに合成されたDNAに5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)が取り込まれると、蛍光標識した抗BrdU抗体または特定の核酸染色剤によって、増殖細胞を間接的に検出することができます。それによって、BrdU標識期間中に、細胞周期のS期を経た細胞の識別を容易にすることができます。
BrdU取り込みを利用した別の方法として、光分解による鎖の切断を用いた導入法(SBIP)があります。この方法では、新たに合成されたBrdUを取り込んだDNAで、UV照射によりDNA鎖切断が誘発されます。細胞を固定して、このようなDNAフラグメントの3'-ヒドロキシル末端にヌクレオチドを共有結合させる哺乳類のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を用いて、in situにて、鎖の切断を検出することができます。切断部位は従来、ハプテンもしくはストレプトアビジンのコンジュゲートに対する抗体と共に、ビオチン化した、あるいはハプテン化したdUTPコンジュゲートを用いて標識されていました。また、これと同じ用途では、蛍光を発するdUTPコンジュゲートを用いて、鎖の切断を直接標識していました。BrdU取り込みに基づく従来の増殖アッセイとは異なり、SBIPを用いると、標識された鎖の切断を視覚化するためにDNAを加熱したり酸変性させる必要がなく、核タンパク質と他の細胞構成要素の形態を免疫細胞化学的分析によって同時に分析することができます。
CyQUANT細胞増殖アッセイキットを用いたNIH 3T3マウス線維芽細胞の定量。485 nmで励起し、530 nmで蛍光検出を行って、マイクロプレートリーダーで測定した。はめ込み図は、細胞数が非常に少なくても直線性が得られることを示す。
BrdUに基づく従来の多くの細胞増殖アッセイプロトコールは、取り込まれたBrdUをさらすためにDNAを変性させる必要があります。しかし、このような厳しい処理を行うと、抗原と他の細胞構造が十分に保存されず、さらに染色を行うことが困難になる場合があります。一方、ABSOLUTE-S SBIP細胞増殖アッセイキットは、SBIP(光分解誘導性鎖切断)法を利用しており、下記のことが可能になります。
- 細胞の特徴と抗原部位がより良好に保存されます。
- DNAを変性させるための酸による洗浄が必要ありません。
- 低レベルシグナルを増幅することができます。
Alexa Fluor 488標識抗BrdU抗体コンジュゲートを用いると、高感度検出を行うことができます。
DNA鎖切断を直接標識するために、当社ではChromaTide BODIPY FL-14-dUTPとChromaTide テキサスレッド-12-dUTPを提供しています。これら蛍光性dUTP類似化合物を、標準的なターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応におけるDNA鎖切断に加えます。BrdUの取り込みとその後の識別を行うため、お客様の用途に応じた多様な蛍光色を有するBrdU、BrdUTP、および抗BrdUマウスIgG1モノクローナル抗体のコンジュゲートも提供しています。
抗BrdUマウスモノクローナル抗体、PRB-1(IgG1サブクラス)の標識コンジュゲート
| 色素 |
励起/蛍光* |
Cat.No. |
| 未標識 |
NA |
A21300 |
| Alexa Fluor® 488 |
495/519 |
A21303 |
| Alexa Fluor® 532 |
531/554 |
A21307 |
| Alexa Fluor® 546 |
556/573 |
A21308 |
| Alexa Fluor® 594 |
590/617 |
A21304 |
| Alexa Fluor® 647 |
650/665 |
A21305 |
| Alexa Fluor® 660 |
667/690 |
A21306 |
| Alexa Fluor® 680 |
679/702 |
A31859 |
| ビオチン |
NA |
A21301MP |
| * およその最大励起(Ex)と最大蛍光波長(Em)(nm)。NA=非適用 |
ABSOLUTE-S SBIP細胞増殖アッセイキットを用いて染色した増殖しているヒトリンパ腫細胞。5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)を取り込んだ増殖細胞は緑色に染色されるが、壊死細胞は赤色に染色される。
光分解(SBIP)手法による鎖切断導入で生じる一連の事象を図示6。(A)新たに合成されたDNAにはBrdU(*)が取り込まれている。(B)UV光にさらしてDNA鎖切断を誘発する。UV照射前にヘキスト33258で細胞を染色した場合には、光分解効率が増大する。(C)細胞を固定すると、これら鎖切断部位でさらされる3'-ヒドロキシル末端は、哺乳類ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)と当社のChromaTide BODIPY FL-14-dUTPもしくはChromatideテキサスレッド-12-dUTPを用いてin situにて直接標識することができる。
アミン反応性CFDA SE(CFSE)色素による細胞標識
蛍光色素のサクシニミジルエステル(SE)は現在最も広範囲に使用されている細胞の世代分析用プローブです。蛍光を発するSEは、リジン側鎖や他の反応可能なアミン基と反応して、自発的、非可逆的に細胞内タンパク質と細胞表面タンパク質両方に結合します。細胞が分裂する時、SE標識は娘細胞に等しく分配されるので、親の蛍光の半分になります。その結果、増殖細胞群の連続する世代は、細胞蛍光強度が半分になることによってマークすることができます。これはフローサイトメトリーによって容易に追跡することができます。
この用途に最も一般的に使用されている色素は、カルボキシフルオレセインジアセテート、サクシニミジルエステル(5(6)-CFDA SEまたはCFSE)です。CFDA SEでは細胞標識はより均質です。その結果、膜マーカーPKH26のような他の細胞追跡色素に比べ良好に世代間を分けることができます。CFDA SE標識のフローサイトメトリー分析を用いて、リンパ球の8〜10連続世代を解像することができます。移植された細胞では、何週間もin vivoでCFDA SEのシグナルを追跡することができます。
InvitrogenのVybrant CFDA SE細胞トレーサーキットには、10本の1回使用分の量が入ったバイアルに入っているCFSE色素、色素溶液調製用の高品質DMSO、プロトコールが含まれています。CellTrace CFSE細胞増殖キットには、フローサイトメトリー実験を行うのに適切な量のCFSE色素と、この機器を用いる増殖試験のプロトコールが含まれています。個々のサクシニミジルエステル色素も単品試薬としてご購入いただけます。下表をご参照ください。
トレーサーとしての関連情報については、「細胞トレーシングツール」の章の「長期細胞トレーシング試薬」の節も参照ください。
細胞増殖試験用蛍光サクシニミジルエステル
| 製品 |
サイズ |
励起/蛍光* |
蛍光 |
Cat.No. |
| Vybrant CFDA SE細胞トレーサーキット(CFDA SE色素を含む) |
100×500 μg |
492/517 † |
エステル加水分解後にのみ蛍光を発する |
V12883 |
| カルボキシフルオレセインジアスターゼ、サクシニミジルエステル(CFDA SE; CFSE) |
25 mg |
492/517 † |
エステル加水分解後にのみ蛍光を発する |
C1157 |
| CellTrace CFSE 細胞増殖キット |
10×50 μg |
492/517 † |
エステル加水分解後にのみ蛍光を発する |
C34554 |
| CellTraceオレゴングリーン488カルボン酸ジアセテート |
20×50 μg |
492/518 |
エステル加水分解後にのみ蛍光を発する |
C34555 |
| * 脱エステル化細胞トレーサーのおよその最大励起(Ex)最大蛍光(Em)(nm)。細胞環境によって値はいくらか変動する。†pH依存性スペクトル。スペクトルはpH>9で測定。 |
脂質性原形質膜染色剤による細胞標識
膜を通して生細胞に脂質性色素をロードします。細胞は高濃度の脂質性色素に耐性を示すだけでなく、たとえ色素を部分的に適用しても、膜内で色素が外側に拡散するので、細胞全体を染色することができます。分裂している細胞は脂質性トレーサーを娘細胞にほぼ均一に分配します。非同期分裂時は測定が瞬時に複雑にはなりますが、通常、フローサイトメトリーによって少なくとも3ないし4世代は細胞を追跡することができます。
カルボシアニンは知られている中で最も強く光を吸収する色素のひとつであり、膜の染色に有用なツールであることが証明されています。最も広く使用されているカルボシアニン膜プローブは、オクタデシル(C18)インドカルボシアニン、DiIとDiDおよびオキサカルボシアニンDiOです。DiOは緑色蛍光を発し、DiIは橙赤色蛍光を、DiDは近赤外蛍光を発します。当社のVybrantマルチカラー細胞標識キットには、DiI、DiO、DiD色素各々を溶解した試料と、細胞および組織染色用プロトコールが含まれています。色素はそれぞれ単品試薬としてもご購入いただけます。
ヒト末梢血リンパ球を採取し、第0日にCellTraceオレゴングリーン488で染色した。マイトマイシンCを用いて、細胞群の一部の増殖を親世代で止めた(赤色ピーク)。試料の残りをフィトヘムアグルチニンで刺激し、5日間増殖させた。実線の緑色の最大は連続する世代を示す。
Vybrant CM-DiI細胞標識溶液には、チオール反応性クロロメチル基を有するDiIが含まれています。これは固定と浸透の操作を通じて、幾つかの細胞には良好に保持されます。また、DiIよりもやや水溶性が高いため、細胞懸濁液と固定細胞用の染色溶液調製が容易です。
当社のVybrant製品のカルボシアニン色素には下記のような利点があります。
- 膜全体に拡散し、細胞全体を染色します。
- 水中では弱く蛍光を発します。
- 吸光係数が高く、非常に明るいシグナルを発します。
- 膜に良好に保持されます。
- 他の細胞への移動が非常に少ないことが示されています。
トレーサーとしての関連情報については、「細胞トレーシングツール」の章の「ニューロントレーシング用カルボシアニン膜色素」の節も参照ください。
製品：
| Cat.No. |
製品名 |
サイズ |
| A21300 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1 (anti-BrdU) |
350 µL |
| A21301MP |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, biotin-XX conjugate |
350 µL |
| A21303 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 488 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 488 conjugate) |
350 µL |
| A21304 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 594 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 594 conjugate) |
350 µL |
| A21305 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 647 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 647 conjugate) |
350 µL |
| A21306 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 660 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 660 conjugate) |
350 µL |
| A21307 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 532 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 532 conjugate) |
350 µL |
| A21308 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 546 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 546 conjugate) |
350 µL |
| A31859 |
anti-bromodeoxyuridine, mouse IgG1, monoclonal PRB-1, Alexa Fluor® 680 conjugate (anti-BrdU, Alexa Fluor® 680 conjugate) |
350 µL |
| A23150 |
ABSOLUTE-S SBIP Cell Proliferation Assay Kit *with Alexa Fluor® 488 anti-BrdU* |
1 kit |
| B21550 |
5-bromo-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate (BrdUTP) *10 mM in TE buffer* |
25 µL |
| B21551 |
5-bromouridine 5'-triphosphate (BrUTP) *10 mM in TE buffer* |
25 µL |
| B23151 |
5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) |
100 mg |
| C1157 |
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (5(6)-CFDA, SE; CFSE) *mixed isomers* |
25 mg |
| C195 |
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate (5(6)-CFDA) *mixed isomers* |
100 mg |
| C34554 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit *for flow cytometry* |
1 kit |
| C34555 |
CellTrace Oregon Green 488 carboxylic acid diacetate, succinimidyl ester |
20 x 50 μg |
| C35007 |
CyQUANT NF Cell Profiliferation Assay Kit *200 asssays* |
1 kit |
| C35006 |
CyQUANT NF Cell Profiliferation Assay Kit *1000 asssays* |
1 kit |
| C7026 |
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit *for cells in culture* *1000 assays* |
1 kit |
| C7027 |
CyQUANT cell lysis buffer *20X concentrate* |
50 mL |
| C7614 |
ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP *1 mM in TE buffer* |
25 μL |
| C7631 |
ChromaTide Texas Red-12-dUTP *1 mM in TE buffer* |
25 μL |
| V12883 |
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit |
1 kit |
| V22885 |
Vybrant DiI cell-labeling solution |
1 mL |
| V22886 |
Vybrant DiO cell-labeling solution |
1 mL |
| V22887 |
Vybrant DiD cell-labeling solution |
1 mL |
| V22888 |
Vybrant CM-DiI cell-labeling solution |
1 mL |
| V22889 |
Vybrant Multicolor Cell-Labeling Kit *DiO, DiI, DiD solutions, 1 mL each* |
1 kit |
