細胞増殖および生存率用ツール
細胞生存率
生細胞とその環境は多様であるため、1種類のアッセイで全てのタイプの細胞に適用することができる生存率アッセイを考案することは不可能です。生存率はひとつの生理学的パラメーターや形態学的パラメーターでは容易に定義することができないので、酵素活性、膜完全性、酸化還元(redox)電位などの幾つかの異なる測定値を組み合わせます。各アッセイ法には固有の利点と限界があり、実験に特異的な偏りをもたらす場合があります。従って、用途に合わせて方法を変える必要があります。Invitrogenの細胞生存率蛍光分析アッセイは、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光マイクロプレートリーダーあるいはフローサイトメーターを用いて容易に行うことができ1、従来の比色アッセイや放射活性に基づくアッセイよりも多くの利点があります。
フローサイトメトリーでの関連情報については、「フローサイトメトリー」の章も参照してください。
細胞の生存率を評価する製品
| 製品 |
注釈 |
| カルセインAMエステル |
- アセトキシメチル(AM)基は色素内を細胞に自由に拡散させる。その後、細胞内エステラーゼはAM基を切断し、色素は細胞内に保持される。
- 幾つかのカルセインAM色素が利用可能
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| LIVE/DEAD生存率毒性キット |
- 2色アッセイにはカルセインAM(緑色蛍光)とエチジウムホモダイマー-1(死細胞染色剤、赤色蛍光)が含まれている。
- アッセイでは洗浄は必要ない。
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| Vybrant細胞代謝アッセイキット |
- キットには膜透過性色素C12-レザズリンが含まれている。これは代謝的活性のある細胞では赤色蛍光を発するC12-レゾルフィンに還元される。
- 蛍光シグナルは試料中の生細胞数に比例する。
- アッセイの感度が高く、ハイスループットマイクロプレートアッセイでも、非常に少数の細胞を検出できる。
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| LIVE/DEAD細胞バイタリティアッセイキット |
- キットにはC12-レザズリンと原形質膜非透過性核酸染色剤が含まれている。
- アッセイは、細胞の代謝活性と膜完全性に基づく幾つかの細胞群の検出に特に適している。
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| Vybrant細胞毒性アッセイキット |
- 損傷を受けた細胞から周辺溶媒へ放出される細胞質酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)をモニターする。
- 赤色蛍光を発するレゾルフィンへとレザズリンが還元される2段階酵素プロセスを経てG6PDを検出。
- 放出されたG6PDの量は試料中の死細胞数に相関する。
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| LIVE/DEAD reducedバイオハザード細胞生存率キット |
- 潜在的バイオハザードの取り扱いに関連するリスクを低減するためにデザインされた。
- キットは原形質膜非透過性核酸色素をベースにしている。膜が損傷した細胞は強く蛍光を発する。
- 緑色、赤色、青色蛍光バージョンが利用可能。
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| LIVE/DEAD精子生存率キット |
- 精子の生存率および受精能力を分析する蛍光に基づいた新しいアッセイ。
- 膜透過性核酸色素と死細胞染色剤を使用しており、可視光励起によって迅速に生細胞と死細胞を区別することができる。
- 色素はその後の卵母細胞の受精や胚の発達に干渉しない。
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| LIVE/DEAD細胞媒介細胞傷害性キット |
- フローサイトメトリーによるナチュラルキラー、リンホカイン活性化キラー、T細胞媒介細胞傷害性測定用に開発された。
- 長期間にわたる細胞傷害性評価用。
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| 膜非透過性核酸色素 |
- 様々な蛍光色の原形質膜非透過性核酸染色剤を単独で利用可能。
- 膜が損傷した細胞は強い蛍光を発する。
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| BacLight edox Sensor Green Vitality counting kit |
- 細菌のvitalityの指標として還元酵素活性を測定
|
| LIVE/DEAD FungaLight Yeast Vialibity kit |
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エステラーゼ活性を検出するカルセインAMエステル
蛍光色素のアセトキシメチル(AM)エステルは細胞内エステラーゼの優れた基質です。バイタリティ(酵素活性を介する)と膜完全性の両方の検出にこの色素AMエステルが有効です。AM基は電気的に中性もしくはほぼ中性の分子で、ほとんどの細胞に自由に色素を拡散させます。細胞内にひとたび入ると、この非蛍光エステラーゼ基質は、非特異的細胞内エステラーゼによって蛍光を発する産物に変換されます。この蛍光産物は原形質膜が損傷を受けていない細胞に保持されます。一方、酵素活性が低下した細胞および/あるいは膜が損傷を受けた細胞は、加水分解していない基質と加水分解した産物のどちらも保持しません。生存能力を有する細胞からの色素消失率は細胞のタイプに大きく依存していますが、低いインキュベーション温度と、高電荷のエステラーゼ産物は、多くの場合は保持に有利です。
InvitrogenのLIVE/DEAD生存率/細胞毒性キットに含まれる試薬は、生細胞群と死細胞群を2色に区別することができます。膜透過性カルセインAMは、生細胞の細胞内エステラーゼによって切断され、細胞質は緑色の蛍光を発します。膜が損傷した死細胞は、膜非透過性核酸色素、エチジウムホモダイマー-1で染色します。?495 nmで励起すると、カルセインAMとエチジウムホモダイマー-1から発せられる蛍光は、それぞれ?515 nmと?635 nmに区別されます。このアッセイは1時間以内で終了します。また、洗浄する必要がなく、蛍光マイクロプレートリーダーと蛍光顕微鏡検査に対応し、フローサイトメーターの使用に容易に適応できます。
Invitrogenは、LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キットに加え、他の幾つかの色素のAMエステルも単品試薬としてご購入いただけます。下表をご参照ください。
蛍光インジケーターのアセトキシメチル(AM)
エステル
| 色素 |
励起/蛍光* |
サイズ |
Cat.No. |
| カルセインブルーAM† |
360/450 |
1 mg |
C1429 |
| CellTraceTMカルセインブルーAM |
360/450 |
20 × 50 μg |
C34853 |
| カルセインAM |
494/517 |
1 mg |
C1430 |
| カルセインAM |
494/517 |
20 × 50 μg |
C3100MP |
| カルセインAM、DMSO溶液 |
494/517 |
1 mg/mL |
C3099 |
| CellTraceTMカルセイングリーンAM |
494/517 |
20 × 50 μg |
C34852 |
| CellTraceTMカルセインレッド-オレンジAM |
577/595 † |
20 × 50 μg |
C34851 |
| * 脱エステル化細胞トレーサーのおよその最大励起(Ex)最大蛍光波長(Em)(nm)。値は細胞環境によってやや変動すると思われる。†固有の蛍光。バックグラウンド蛍光を最小限に抑えるにはさらに洗浄する必要があると思われる。 |
代謝活性の検出
代謝の活性を有する細胞は、様々なプローブを酸化あるいは還元するので、細胞生存率と全体的な細胞の健康度を測定することができます。生存率の測定は、エステラーゼ活性や細胞の透過性を検出するようにデザインされたプローブを利用するものとは異なります。Invitrogenは、酸化-還元インジケーターであるC12-レザズリンに基づいて生存率を示す2種類のキットと、損傷を受けた細胞によるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの放出を検出するキットを提供しています。
生存能力のある細胞によって還元されて赤色蛍光を発するレゾルフィンになる非蛍光性レザズリンは、細菌から高等真核生物までの様々なタイプの細胞の代謝活性を検出するために広く使用されています。Vybrant細胞代謝アッセイキットには、細胞透過性と保持性がレザズリンよりも優れている脂質性C12-レザズリンが含まれています。C12-レザズリンはひとたび細胞内に入ると、還元されて赤色蛍光を発するC12-レゾルフィンになります。この還元産物は非修飾レゾルフィンよりも良好に保持されるので、より明るいシグナルが得られ、検出限界もよくなります。C12-レゾルフィンのスペクトルの特徴は、レザズリンと同じです(最大励起/蛍光?563/587)。従って、機器やフィルターを変更することなく、レザズリン用にデザインされた実験に、C12-レゾルフィンを組み込むこともできます。
当社のLIVE/DEAD細胞生存率/細胞毒性アッセイキットに含まれる試薬で染色したウシ肺動脈内皮細胞の生細胞(緑色)とエタノール固定細胞(赤橙色)。
CellTraceTMカルセイングリーンAMあるいはCellTraceTMカルセインレッド-オレンジAMあるいはCellTracerTMカルセインブルーAMと共にJurkat細胞をインキュベートした。標識された細胞を合わせ、適切なフィルターで画像化した。
Vybrant細胞代謝アッセイキットは、代謝活性を有する細胞のインジケーターとしてC12-レザズリンを使用しており、標準曲線作成用にレゾルフィンを含んでいます。還元されたインジケーターC12-レゾルフィンが発する蛍光は、細胞数に比例しているので、ハイスループットのマイクロプレートベースのアッセイにおいてさえ、非常に少ない数の細胞を検出することができます。
LIVE/DEAD細胞バイタリティキットには、膜完全性検出用のSYTOX緑色核酸染色剤ばかりでなく、酸化-還元インジケーターであるC12-レザズリンが含まれています。このキットは、幾つかの細胞群を、代謝活性と膜完全性に基づいて検出することができます。
Vybrant細胞毒性アッセイキットは、損傷を受けた細胞から周辺溶媒に放出される細胞質内酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)をモニターします。G6PDは、レザズリンが赤色蛍光を発するレゾルフィンに還元される2段階の酵素プロセスを介して検出されます。生じるシグナルは、細胞溶媒に放出されたG6PDの量に比例しており、これは、試料中の死細胞数に相関しています。レゾルフィンは、ほとんどの生物学的試料の自家蛍光よりも強い蛍光を発します。
原形質膜完全性のプローブ
動物細胞、細菌、酵母の生存率の評価では、死細胞群の検出にしばしば極性の細胞非透過性核酸染色剤が使われています。このような核酸染色剤を適切な生細胞インジケーターと組み合わせて使用すると、このふたつの細胞群を1回の実験で区別することができます。このような生細胞インジケーターには、細胞内エステラーゼ基質(上記参照)、膜透過性核酸染色剤(下記参照)、膜電位感受性プローブ、オルガネラプローブあるいは細胞透過性インジケーターがあります。他の多くの細胞非透過性色素も死細胞の検出に使用することができますが、細胞内では核酸濃度が高いことと、結合によって蛍光強度が増す当社のほとんどの核酸染色剤との組み合わせで、必然的に、細胞非透過性核酸染色剤は生存率プローブの候補となります。本節で述べる製品には、生存率測定用キットと、生細胞と死細胞を区別するための単品試薬が含まれています。
Invitrogenは、ウイルス、細菌、原生動物病原体などの潜在的バイオハザードの取り扱いに関連するリスクを低減するようにデザインされた哺乳類細胞の生存率測定キットを4種類、開発しました。LIVE/DEAD reducedバイオハザード細胞生存率キットなら、適切に試料が含まれている場合に生存の染色が行なわれ、その後のグルタルアルデヒド処理によって試料中の細胞あるいはウイルスは不活化され、染色パターンが維持されます。キット#1には生細胞の核酸を緑色蛍光で標識する膜透過性SYTO 10色素と、膜が損傷した細胞の核酸を赤色蛍光で標識するDEAD赤色色素が含まれています。キット#2、#3、#4にはそれぞれ1種類の色素が含まれています。すなわち、緑色蛍光色素、赤色蛍光色素、青色蛍光色素です。膜が損傷した細胞では、この色素は細胞表面上と細胞内のアミンと反応し、強い細胞内染色が得られます。膜が完全な細胞では、色素は細胞表面アミンと反応した後、弱い細胞外蛍光しか発しません。キット#2と#3で標識した細胞は、アルゴンイオンレーザーの488 nmで励起することができますが、キット#4の色素はUV励起を必要とします。
当社のVybrant細胞代謝アッセイキットを用いた、C12-レザズリンの検出限界と漸増細胞数との直線反応。Jurkat細胞にC12-レザズリンをロードし、励起/蛍光530/590 nmにて、蛍光を測定した。同様の比較実験で得られたalamarBlueTMの検出限界は?8000細胞/ウェルだった(データ未公表)。
LIVE/DEAD細胞バイタリティキットを用いたJurkatヒトT細胞白血病細胞の分析。細胞をカンプトテシンで処理し、キット中の試薬と共にインキュベートした。
Vybrant細胞毒性アッセイキットを用いた死細胞と瀕死細胞の検出。Jurkat細胞をカンプトテシンで処理してから、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの放出をアッセイした。生じた蛍光を励起/蛍光?530/590 nmで測定した。未処理のコントロールを比較のために示す。
LIVE/DEAD精子生存率キットは、精子の生存率と受精能力を分析する、蛍光に基づく新しいアッセイキットです2。これは、膜透過性核酸色素SYB 14と死細胞染色剤プロピジウムアイオダイドを使用し、可視光励起によって生細胞と死細胞を迅速に区別します。この色素はその後の卵母細胞の受精や胚の発達に影響しません。
LIVE/DEAD細胞媒介細胞傷害性キットは、蛍光顕微鏡検査によるナチュラルキラー、リンホカイン活性化キラー細胞、T細胞による細胞傷害性の測定用に開発されました。これは、漏出したり分離されることがあるカルセインのような細胞質マーカーを使用した場合に、期間が長すぎて有効に測定できなかったものが長期間、細胞傷害性を評価することができるものです。緑色蛍光膜染色剤DiOC18(3)で前もって標的細胞をインキュベートします。標識された標的細胞を、赤色蛍光膜非透過性色素であるプロピジウムアイオダイド存在下でエフェクター細胞と混合します。ターゲットの生細胞と死細胞は緑色蛍光膜染色剤を保持します。膜が損傷した標的細胞とエフェクター細胞では、赤色蛍光核酸染色が認められます。エフェクター生細胞は蛍光を発しません。
Invitrogenは、幅広い核酸染色剤を取り備えています。当社の広範囲な膜非透過性核酸色素を、下表にまとめています。これら色素は生膜には一般に非透過性ですが、膜が損傷した死細胞を明るく染色します。当社の核酸染色剤の製品リストについてはWebサイト(www.probes.com)をご覧ください。
当社のLIVE/DEAD精子生存率キットに含まれる色素で染色したウシ精子生細胞と死細胞の混合物。精子生細胞はSYB 14(緑色)で標識し、精子死細胞はプロピジウムアイオダイド(赤橙色)で標識した。画像は、Duane L. Garner氏(School of Veterinary Medicine, University of Nevada)および eno氏とLawrence A. Johnson氏(USDA Agricultural esearch Service)からの提供。
- 参考文献：
- 1. J Immunol Methods 243, 155 (2000); 2. J Androl 15, 620 (1994).
インビトロジェンの膜非透過性核酸染色剤
| 色素 |
励起/蛍光* |
備考 |
| SYTOX青色核酸染色剤 |
444/480 |
- 水性溶媒では本質的に蛍光を発しない。
- DNAと結合すると蛍光が500倍以上増大する。
|
| YOYO-1 iodide† |
491/509 |
- 核酸と結合しなければ本質的に蛍光を発さず、DNA結合プロピジウムアイオダイドの10?20倍の吸光係数を示す。
|
| SYTOX緑色核酸染色剤 |
504/523 |
- 水性溶媒では本質的に蛍光を発しない。
- DNAと結合すると蛍光が500倍以上増大する。
|
| TOTO-1 iodide† |
514/533 |
- 核酸と結合しなければ本質的に蛍光を発さず、DNA結合プロピジウムアイオダイドの10?20倍の吸光係数を示す。
|
| エチジウムホモダイマー-1 |
528/617 |
- しばしば赤色蛍光死細胞インジケーターに有利である。
- 核酸に対してエチジウムブロマイドの1000倍以上の親和性を示す。
- DNAと結合すると蛍光が40倍増大する。
|
| プロピジウムアイオダイド |
535/617 |
- フローサイトメトリーに使用される最も一般的な細胞非透過性色素。
- 488 nm励起光源でも、蛍光が近赤外から赤色を見ることができる
- DNAと結合すると蛍光が20?30倍増大する。
|
| SYTOX橙色核酸染色剤 |
547/570 |
- 水性溶媒では本質的に蛍光を発しない。
- DNAと結合すると蛍光が500倍以上増大する。
|
| YOYO-3 iodide† |
612/631 |
- 核酸と結合しなければ本質的に蛍光を発さず、DNA結合プロピジウムアイオダイドの10?20倍の吸光係数を示す。
|
| TOTO-3 iodide† |
642/660 |
- 核酸と結合しなければ本質的に蛍光を発さず、DNA結合プロピジウムアイオダイドの10?20倍の吸光係数を示す。
|
| * 色素-DNA複合体のおよその最大励起(Ex)最大蛍光(Em)(nm)。†これら色素にPOPO-1 iodide、POPO-3 iodide、BOBOTM-1 iodide、BOBOTM-3 iodideを加えたものが、核酸染色剤ダイマーサンプラーキットでは利用可能。 |
製品：
| Cat.No. |
製品名 |
サイズ |
| C1429 |
calcein blue, AM |
1 mg |
| C1430 |
calcein, AM |
1 mg |
| C3099 |
calcein, AM *1 mg/mL solution in dry DMSO* |
1 mL |
| C3100MP |
calcein, AM *special packaging* |
20 x 50 µg |
| C34851 |
CellTrace™ calcein red-orange, AM *special packaging* |
20 x 50 µg |
| C34852 |
CellTrace™ calcein green, AM *special packaging* |
20 x 50 µg |
| C34853 |
CellTrace™ calcein blue, AM *special packaging* |
20 x 50 µg |
| C34858 |
CellTrace™ calcein Violet, AM |
20 x 50 µg |
| C481 |
calcein *high purity* |
100 mg |
| E1169 |
ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
1 mg |
| F7030 |
FUN 1 cell stain *10 mM solution in DMSO* |
100 ™L |
| L23101 |
LIVE/DEAD educed Biohazard Cell Viability Kit #2 *green fluorescence* *200 assays* |
1 kit |
| L23102 |
LIVE/DEAD educed Biohazard Cell Viability Kit #3 *red fluorescence* *200 assays* |
1 kit |
| L23105 |
LIVE/DEAD educed Biohazard Cell Viability Kit #4 *blue fluorescence* *200 assays* |
1 kit |
| L3224 |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for animal cells* *1000 assays* |
1 kit |
| L34951 |
LIVE/DEAD Cell Vitality Assay Kit |
1 kit |
| L34955 |
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit |
200 回分 |
| L34957 |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit |
200 回分 |
| L34958 |
LIVE/DEAD Violet Viability/Vtality Kit |
200 回分 |
| L7009 |
LIVE/DEAD Yeast Viability Kit *1000 assays* |
1 kit |
| L7010 |
LIVE/DEAD Cell-Mediated Cytotoxicity Kit *for animal cells* *2000 assays* |
1 kit |
| L7011 |
LIVE/DEAD Sperm Viability Kit *200-1000 assays* |
1 kit |
| L7013 |
LIVE/DEAD educed Biohazard Cell Viability Kit #1 *green and red fluorescence*
*100 assays* |
1 kit |
| N13195 |
2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) |
|
| N23106 |
6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-deoxyglucose (6-NBDG) |
|
| N7565 |
Nucleic Acid Stains Dimer Sampler Kit |
|
| P1304MP |
propidium iodide |
|
| P21493 |
propidium iodide *FluoroPureTM grade* |
|
| P3566 |
propidium iodide *1.0 mg/mL solution in water* |
|
| 12204 |
resazurin, sodium salt |
|
| S11348 |
SYTOX Blue nucleic acid stain *5 mM solution in DMSO* |
|
| S11368 |
SYTOX Orange nucleic acid stain *5 mM solution in DMSO* |
|
| S7020 |
SYTOX Green nucleic acid stain *5 mM solution in DMSO* |
|
| T3600 |
TOTO-1 iodide (514/533) *1 mM solution in DMSO* |
|
| T3604 |
TOTO-3 iodide (642/660) *1 mM solution in DMSO* |
|
| V23110 |
Vybrant Cell Metabolic Assay Kit *with C12-resazurin* *500-1000 assays* |
|
| V23111 |
Vybrant Cytotoxicity Assay Kit *G6PD release assay* *1000 assays* |
|
| Y3601 |
YOYO-1 iodide (491/509) *1 mM solution in DMSO* |
|
| Y3606 |
YOYO-3 iodide (612/631) *1 mM solution in DMSO* |
|
| B34954 |
BacLight edox Sensor Green Vitality counting kit |
100 assays |
| L34952 |
LIVE/DEAD FungaLight Yeast Vitality assay kit *200 assays* |
200 assays |
| F34953 |
FungaLight CFDA, AM/propidium iodide Yeast Vitality assay kit *200 assays* |
200 assays |
